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    細(xì)胞凍存的實(shí)驗(yàn)步驟&注意事項(xiàng)

    發(fā)布時(shí)間: 2024-04-17  點(diǎn)擊次數(shù): 723次

    細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)用于保護(hù)細(xì)胞免受損傷,以便在需要的時(shí)候重新復(fù)蘇和使用,對(duì)于保存少有的細(xì)胞資源、制備細(xì)胞庫(kù)、研究細(xì)胞生物學(xué)等方面具有重要意義。


    實(shí)驗(yàn)步驟:

    1.細(xì)胞凍存液提前配置:凍存液配置比例根據(jù)實(shí)驗(yàn)習(xí)慣即可,若細(xì)胞不多或使用人數(shù)較少,建議一次少量配置,配置完成后,由于DMSO的存在,因此需要嚴(yán)格避光保存。


    2.需要凍存的細(xì)胞密度要求≥90%,鏡下觀察細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞密度滿(mǎn)足要求后,棄掉原有培養(yǎng)基,沿培養(yǎng)皿邊緣加入1ml溫浴的PBS緩沖液清洗。


    3.棄掉PBS緩沖液,加入胰酶消化細(xì)胞,消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型決定。


    4.消化到時(shí)間后,加入二倍胰酶體積的培養(yǎng)基終止消化,用移液器將細(xì)胞全部吹下,轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。


    5.離心機(jī)常溫800rpm,離心5min。


    6.棄上清,加入1ml配置好的凍存液,用移液器輕輕吹打10-15次混勻。


    7.凍存管標(biāo)記好相應(yīng)信息,包括細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、凍存時(shí)間、操作者姓名等,將上述混懸液全部轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi),擰緊凍存管管口,放入程序降溫盒內(nèi)。


    8.將程序降溫盒放入-80℃冰箱內(nèi),36h后可從程序降溫盒內(nèi)拿出細(xì)胞放在細(xì)胞凍存架上保存。

    細(xì)胞凍存的實(shí)驗(yàn)步驟&注意事項(xiàng)

    常見(jiàn)問(wèn)題

    1.細(xì)胞凍存管具體存放方式、溫度、時(shí)間等由實(shí)驗(yàn)室條件決定,我所述只是我實(shí)驗(yàn)過(guò)程中凍存細(xì)胞的保存方法。

    2.關(guān)于凍存液的配置,我實(shí)驗(yàn)所用配方為培養(yǎng)基:血清:DMSO =7:2:1,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中凍存的細(xì)胞復(fù)蘇狀態(tài)良好。

    注意事項(xiàng)

    1.在凍存管上標(biāo)記信息時(shí)使用一支質(zhì)量較好的馬克筆,保證在后期進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)信息不會(huì)被水或酒精洗掉。

    2.細(xì)胞凍存時(shí)應(yīng)保證細(xì)胞狀良好,無(wú)污染。

    3.細(xì)胞凍存原則為“慢凍",因此,細(xì)胞加入凍存管后如何保存應(yīng)嚴(yán)格遵守凍存流程,避免凍存太快,產(chǎn)生結(jié)晶。

    4.二甲基亞砜(DMSO)是一種細(xì)胞保護(hù)劑,在深低溫情況下可防止細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,減少細(xì)胞損傷,因此凍存液配置中DMSO是不能少的,但可以改變血清的比例,對(duì)于一些原代細(xì)胞或較為重要的細(xì)胞,可將血清比例提高至50%-90%,保證其有較高的存活率。

    5.細(xì)胞凍存后再進(jìn)行復(fù)蘇時(shí),細(xì)胞數(shù)量不可避免會(huì)減少,因此,在凍存前,細(xì)胞量要足夠多,密度≥90%。

    6.細(xì)胞混懸液加入凍存管后,不宜在常溫放置過(guò)久,因此應(yīng)先將細(xì)胞凍存盒放入冰箱,再進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

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